Obsah
- Detekcia pomocou farebných zmien
- Použitie ELISA čítačky na meranie
- Priama kompetitívna ELISA (cytochróm c)
- Primárna protilátka sa inkubuje v skúmavkách
Test ELISA je imunoanalýza založená na enzýmoch, ktorá využíva protilátky alebo antigény spojené so špecifickým enzýmom, aby pomohla určiť koncentráciu protilátky alebo antigénu. Ak užívate test ELISA a nemôžete použiť špecifické protilátky na získanie vašich výsledkov, odporúča sa kompetitívna ELISA, pretože používa antigén konjugovaný s enzýmom namiesto protilátky a odlišnú detekčnú metódu.
Detekcia pomocou farebných zmien
Spoločným protokolom pre kompetitívny test ELISA je použitie neoznačenej a purifikovanej primárnej protilátky. Protilátka potiahne jamky mikrotitračnej platne a inkubuje sa s neznámym štandardom. Potom sa pridá imunogén na konjugáciu s primárnou protilátkou, ktorá sa bude viazať na miesta protilátok, ktoré ešte nie sú obsadené. Substrát sa potom použije na vytvorenie zmeny farby na meranie koncentrácie väzby.
Použitie ELISA čítačky na meranie
Použite mikrotitračnú polystyrénovú platňu a primárne protilátky pridajte do každej jamky. Aby sa dosiahla maximálna väzba, naplňte jamku jedným mikrogramom protilátky. Platňa sa inkubuje štyri hodiny pri teplote miestnosti. Pridá sa primárna zachytávacia protilátka a jamky sa premyjú PBS (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok). Platne s blokovacím pufrom inkubujte dve hodiny pri teplote miestnosti. Jamky dvakrát premyte PBS a pridajte štandardy. Roztok antigén-konjugát sa umiestni do jamiek a inkubuje sa znova dve hodiny. Platňa sa premyje štyrikrát PBS. Pridá sa substrát a zmeria sa hustoty na špecifickej vlnovej dĺžke pomocou čítačky ELISA.
Priama kompetitívna ELISA (cytochróm c)
Pre priamy kompetitívny test ELISA sa musí vykonať analýza riedenia séra pre antigén, ktorý používate v experimente. Mikrotitračná doštička sa potom potiahne cytochrómom c a inkubuje sa cez noc. Časť testu ELISA sa potom vykoná pridaním blokovacieho činidla a sekundárnej protilátky. Výsledky absorbancie sa odčítajú pomocou čítačky mikrodoštičiek.
Primárna protilátka sa inkubuje v skúmavkách
V tomto postupe sa primárna protilátka inkubuje v testovacích skúmavkách, v ktorých sa k nej viaže požadovaný antigén. Vzorky sa potom pridajú do jamiek mikrotitračných platní a inkubujú sa. Jamky sa potom premyjú, aby sa odstránili akékoľvek neviazané komplexy antigén-protilátka, a potom sa pridá blokovací roztok, aby sa zabránilo naviazaniu druhej protilátky na jamky. Sekundárna protilátka sa potom odčíta na čítačke platní, aby sa získali výsledky.